摘 要：采用大孔吸附树脂分离纯化技术，对适合分离纯化松花粉中黄酮成分的树脂进行筛选，通过静态的吸附与解析,筛选出最优型号，用此型号考察各因素对松花粉黄酮纯化工艺条件的影响。结果表明：采用D101大孔树脂，上样液浓度 0.358 mg/mL，用50%乙醇溶液以 1 mL/min 的速度洗脱3BV，松花粉总黄酮纯度可达80%以上。
　　关键词：松花粉；黄酮；大孔吸附树脂；纯化
　　松花粉为松科植物马尾松（Pinus massoniana Lamb.）、油松（Pinus tabuli formis Carr.）或同属数种植物的干燥花粉。具有收敛止血、燥湿敛疮的功效，用于外伤出血，湿疹，黄水疮，皮肤糜烂，脓水淋漓。松花粉中含有黄酮类、多糖、胆碱、脂肪酸类、蛋白质、微量元素等多种成分，国内外临床验证松花粉具有抗疲劳、降血糖、抗衰老、抑制前列腺增生、护肝、调节免疫功能、减肥、美容等多种药理作用,被誉为“花粉之王”。本课题将对松花粉中黄酮类化合物的纯化工艺进行了深入系统地研究，以期为进一步研究松花粉的进一步开发利用提供参考性依据。
　　1 实验材料
　　1.1仪器
　　FA1004N分析天平（上海第二分析仪器厂）；UV765紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（山海安亭实验仪器有限公司）；层析柱 2cm×50cm （锦州市友晟化玻经销处）；D101型大孔树脂(天津农药厂生产) ；AB- 8 、X-5 ( 天津南开大学化工厂生产)
　　1.2试药
　　松花粉（购于陕西省药材市场，经生药教研室雷国莲教授鉴定为松科植物马尾松的花粉）； 芦丁对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。
　　2 总黄酮的含量测定方法
　　2.1总黄酮含量的测量：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法。芦丁标准液浓度 Y(mg/mL)与吸光度 X 的关系为：Y=4.1164X-0.0368（R2=0.0998）。
　　2.2黄酮上样液的准备：取松花粉700g，加10倍量60%的乙醇提取2次，每次1.5h。提取液过滤、减压回收乙醇，浓缩至无醇味，以水稀释至5000 ml，作为供试液。（总黄酮含量为0.497mg/ml）
　　3 纯化工艺的研究
　　3.1大孔树脂的预处理
　　将层析柱清洗干净，以防其他物质对树脂的污染，排净柱内水分，于层析柱内加入95%乙醇，将新树脂投入柱中，浸泡24h，用95%乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，直至流出液1ml加4ml蒸馏水不呈白色混浊为止，然后用蒸馏水以同样流速洗至无醇味；用2BV5%HCl以6BV/h流速通过树脂层，并浸泡4h，后用蒸馏水以同样流速洗至出水PH中性，用2BV2%NaOH以6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4h，后用蒸馏水以同样流速洗至出水PH中性。
　　3.2树脂的筛选
　　3.2.1不同大孔树脂对松花粉总黄酮的静态吸附量实验
　　精密称取处理好的三种树脂各 1g，置于 50mL 具塞磨口三角瓶中，加入精密量取的供试液 20mL，振荡器上持续振摇 12h，使充分吸附，取上层液 1mL 测定总黄酮含量，结果见表1。
　　3.3不同吸附树脂对松花粉总黄酮静态洗脱性能考察实验树脂静态洗脱
　　利用上一步静态饱和吸附总黄酮后的树脂，滤出吸干表面水分，精密加入 80%乙醇，振荡器上振摇 12h，测定总黄酮含量，结果见表2。
　　由表1、表2可以看出，无论是饱和吸附量还是洗脱率， D-101均表现出了最佳性能，故选择D-101型大孔吸附树脂对松花粉总黄酮进行纯化实验。
　　3.5 D101 型大孔树脂的纯化工艺。
　　3.5.1上样流速
　　取处理过的 D101 型树脂 3g，湿法装柱，将 4 份供试液（总黄酮浓度为0.497mg·mL-1）20mL 分别以 0.5mL·min-1、1.0mL·min-1、1.5mL·min-1、2.0mL·min-1的流速通过树脂柱吸附，测定吸附率，结果见表3。
　　由表3可以看出，上样的流速控制为1.0～1.5mL·min-1为佳。
　　3.5.2上样浓度
　　取供试液3份各 20mL 加入树脂柱内，控制流速为 1mL·min-1，收集流出液，在 500nm 处测定吸光度，计算吸附率，结果见表4。
　　由表4可以看出，树脂对3份样液的吸附率与浓度有关，浓度越大，吸附率越高。
　　3.5.4 pH 值
　　取供试液 20mL，用 1mol·L-1HCl 调节 pH 值为 3、4、5、6、7，控制流速 1mL·min-1进行吸附，用 50%的乙醇以 1mL·min-1的流速洗脱，收集洗脱液，于 500nm 处测定吸光度计算总黄酮含量，结果见表5。
　　由表5可知，上样液PH值调至5.0-6.0为佳。
　　3.5.5上样量
　　取供试液加入树脂柱内，控制流速 1mL·min-1进行吸附，每1BV体积流出液为一份，500nm 处测定并计算总黄酮含量，绘制D101 大孔树脂的泄漏曲线。见图1。
　　由图1可知，当样品流出液体积为6BV时，大孔树脂接近饱和状态。此时，树脂与原药材比约为1:3。
　　3.5.5洗脱剂浓度
　　分别移取供试液 20mL（总黄酮浓度为 0.497mg·mL-1），以 1mL·min-1的流速进行动态吸附后，先用6BV 水以 1mL·min-1的流速洗脱，再依次用 10%、30%、50%、70%.90%的乙醇5BV 以 1mL·min-1的流速梯度洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中黄酮含量，并计算黄酮的解吸附率，结果见表6。
　　由表6可以看出，50%乙醇的解吸附效果最好。
　　2.3.6洗脱速度
　　取4份供试液各 20mL 以 1mL·min-1的流速进行吸附，用 50%的乙醇洗脱，流速分别为 0.5mL·min-1、1.0mL·min-1.1.5mL·min-1、2.0mL·min-1，收集洗脱液，于 500nm处测定吸光度，计算总黄酮含量，结果见表7。
　　由表7可知，洗脱速度以0.5～1.0mL·min-1为佳。
　　3.5.7纯化后松花粉总黄酮纯度测定
　　从表 8 可以看出，使用大孔树脂纯化松花粉总黄酮后，纯度可以达 80%以上，而且重现性良好。
　　4 结论
　　研究结果表明，D101型大孔吸附树脂对松花粉黄酮的纯化相对较好，具有较高的吸附率和解析率；采用 D101 大孔吸附树脂对松花粉黄酮纯化的工艺研究过程中，研究了多个因素对上样效果和洗脱效果的影响。最终得到的工艺是：上样液浓度 0.358 mg/mL，上样液流速1 mL/min，用50%乙醇溶液以 1 mL/min 的速度洗脱3BV，松花粉总黄酮纯度可达80%以上。
　　参考文献
　　[1]中国保健协会养生专业委员会宣传部.国珍松花粉的药理研究与临床应用[J].健康顾问，2005，17:48- 51.
　　[2]王敏.松花粉的成分及药理作用研究进展[J].安徽医药，2008，12(4):357-359.
　　[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:333
　　作者简介：
　　彭修娟（1981-），女，山东临沂人，研究生，讲师，研究方向：中药药效物质基础研究。 相关文档：
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